مواد مورد نیاز
مقدار مواد

تریس به یس
۱۰۸ گرم

بوریک اسید
۵۵ گرم

EDTA
۵/۷ گرم

برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده از ژل آگارز ۷/۰ درصد استفاده شد. برای تهیه آگارز ۷/۰ درصد با توجه به حجمژل (طول ژل× عرض ژل× ضخامت ژل)، به مقدار لازم از پودر آگارز وزن‌کشی شده و با بافر TBE(1X) به حجم موردنظر رسانده شد. سپس تا رسیدن به دمای جوش حرارت داده شد، به شیوه‌ای که رنگ محلول کاملا شفاف شود. بعد از آن که محلول به اندازه کافی خنک شد و دمای آن به ۴۰ تا ۵۰ درجه سانتی‌گراد رسید، در سینی ژل که از پیش آماده شده بود، ریخته شد تا ژل کاملا ببندد. بعد از جدا کردن شانه و شکل گیری چاهک‌ها، سینی حاوی ژل در تانک الکتروفورز که آن نیز دارای بافر TBE(1X) بود قرار داده شد. برای بار کردن نمونه‌ها در داخل هر چاهک، ۲ میکرولیتر از DNA استخراج شده با ۱ میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شده و داخل چاهک‌ها ریخته شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

بافر بارگذاری دو کار مهم انجام می‌دهد. اول اینکه چون دارای گلیسرول است، نمونه‌های DNAرا سنگین‌تر از تامپون الکترود (۱X)TBE نموده و باعث می‌شود نمونه‌های DNA در ته چاهک‌ها قرار گیرند. دوم اینکه به دلیل رنگی بودن محلول فوق، امکان ردیابی DNA در جریان الکتروفورز وجود دارد.
دستگاه الکتروفورز به دستگاه تأمین نیروی برق متصل و الکتروفورز با ولتاژ ثابت ۸۵ ولت انجام شد. نمونه‌ها به مدت ۴۵ تا ۵۵ دقیقه داخل ژل آگارز موجود در تانک حرکت کردند (برای حرکت نمونه‌ها از قطب منفی به قطب مثبت می‌باشد). سپس ژل از تانک الکتروفورز برداشته و به مدت ۵ دقیقه داخل محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت. برای مشاهده باندها و تعیین کیفیت DNA، ژل به دستگاه مستندسازی ژل منتقل شده و از آن عکس تهیه شد.
۳-۳-۴-۲- تعیین کمیت و کیفیت DNA با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتری
ابتدا در کوت دستگاه اسپکتروفوتومتر آب دو بار تقطیر شده استریل (حلال نمونه‌هایDNA استخراجی) ریخته شد و دستگاه در طول موج‌های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر کالیبره شد. سپس حجم مشخصی از DNA بسته به ضریب رقت، با حجم مشخصی آب دوبار تقطیر شده استریل رقیق و درون کوت ریخته شد. شدت نور در طول موج‌های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر اندازه‌گیری شد و در نهایت غلظت DNA، میزان آلودگی پروتئینی و میزان خلوص DNA برآورد شد.
به طور کلی برای اندازه‌گیری غلظت DNA دو رشته‌ای از فرمول زیر استفاده می‌شود.
معادله ۳-۱:
مقدار جذب نور در nm260 × ۵۰ × ضریب رقت = غلظت DNA (میکروگرم در میلی‌لیتر)
با توجه به نسبت جذب نور در طول موج‌های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر، می‌توان کیفیتDNA و خلوص آن را تخمین زد ((OD260/OD280 چنان‌چه این نسبت بین ۹۵/۱-۸۵/۱ باشد، کیفیت و خلوص DNA در بهترین حالت است. آلودگی‌های پروتئینی باعث کاهش این نسبت و وجود RNA زیاد در نمونه، باعث افزایش آن می‌شود.
۳-۴- واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR)
در این واکنش قطعه مورد نظر برای بررسی وجود چند شکلی، با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی تکثیر شد.
۳-۴-۱- پروتکل و مواد مورد استفاده در PCR
اجزای واکنش زنجیره‌ای پلی مراز و نقش هر یک از آن‌ها به شرح زیر می‌باشد:
- DNA الگو که قطعه مورد نظر از روی آن تکثیر می‌شود.
- دو قطعه آغازگر که به دو سر ׳۳ یا ׳۵ DNA الگو متصل می‌شوند.
- DNA پلی‌مراز مقاوم به حرارت که وظیفه آن گسترش رشته جدید به وسیله دزوکسی نوکلئوتیدها می‌باشد.
- دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته که اجزای سازنده DNA رشته جدید هستند.
- محلول بافر که محیط مناسبی را برای فعالیت و پایداری پلی مراز و خود DNA فراهم می‌آورد.
- کلرید منیزیم که در این واکنش به عنوان سیمان اتصال دهنده بلوک‌های همانند سازی یا همان dNTP ها عمل می‌کند.
لازم به ذکر است که تمامی مواد مورد نیاز به جز آغازگرها از شرکت سیناژن تهیه شدند. توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش برای هر کدام از نشانگرها در جدول ۳-۵ آمده است.
جدول ۳-۵- توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش

منبع
دمای اتصال
جایگاه
اندازه محصول
توالی آغازگر
ژن