دانلود مطالب پژوهشی در رابطه با توسعه تست ...

ارسال شده در 17 آذر 1400 توسط نجفی زهرا در بدون موضوع

غلظت ۲ میکروگرم از آنتی ژن

رقت ۴۰۰۰۰ : ۱ و ۱:۳۰۰۰۰ از کونژوگه

۳-۶-۲- استفاده از لیزات باکتری در الایزا
لیزات باکتری BL21(DE3)pLYsS در مرحله ۴ استفاده شد زیرا ناخالصیهای موجود در پروتئینهای PUET-GRA7 و PUET-GRA6 تخلیص شده ممکن است با سرم افراد (آنتی بادی بر علیه باکتری موجود در سرم) واکنش بدهد . لذا در این تحقیق با افزودن درصدهای مختلف لیزات اشرشیا کلی به رقیق کننده سرم مانع ایجاد واکنش غیر اختصاصی آنتی ژن ناخالص با آنتی بادی بر علیه باکتری موجود در سرم افراد شدیم .
مواد و وسایل مورد نیاز برای تهیه لیزات باکتری BL21(DE3)pLYsS

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

سلولهای BL21(DE3)pLYsS

محیط کشت LB مایع حاوی ۳۴ µg/ml کلرامفنیکل ۵۰۰ میلی لیتر

کلرامفنیکل Sigma

روش کار :۱ – از استوک Ċ۷۰- سلولهای BL21(DE3)pLYsS بر روی سطح پلیت LB آگار حاوی کلرامفنیکل کشت داده شد و برای تمام شب در انکوباتور Ċ ۳۷ قرار گرفت . صبح روز بعد در ۲ میلی لیتر محیط کشت LB مایع حاوی آنتی بیوتیک کلرامفنیکل ، کشت داده شدند و پس از ۲-۱ ساعت ، به حجم ۲۰ میلی لیتر با محیط کشت تازه حاوی آنتی بیوتیک مناسب رسید و پس از ۲ ساعت به حجم نهایی ۵۰۰ میلی لیتر رسانده شد .
۲ – کشت باکتریایی در Ċ ۳۷ و دور ۲۰۰ rpm انکوبه شد تا کاملا” اشباع گردد.
۳ – سپس کشت باکتریایی به مدت ۳۰ دقیقه با ۶۰۰۰ rpm در Ċ ۴ سانتریفوژ شد.
۴ – پلیت باکتریایی بدست آمده در ۲۰ میلی لیتر PBS پخش گردید و لیزوزیم با غلظت نهایی ۱ mg/ml به آن اضافه شد . یک ساعت در Ċ ۴ نگه داشته شد و در این مدت چندین بار تکان داده شد، سپس با سونیکاسیو.ن (۵ بار هر بار ۱ دقیقه) سلولها لیز شد .
۳-۷- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم
این روش الایزا برای تیتراسیون آنتی بادی در نمونه های سرم و یا تعیین آنتی بادی اختصاصی مورد استفاده قرار می گیرد . اساس آزمایش بدین نحو است که معمولا” سرم رقیق شده به آنتی ژنهای کوت شده در فاز جامد (میکروول یا چاهک) اضافه می شود . آنتی ژن کوت شده آنتی ژن اختصاصی مربوط به آنتی بادی است که قرار است در نمونه رد یابی شود ، پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو آنتی بادی کونژوگه با آنزیم به چاهک اضافه می شود که این آنزیم یک سوبسترای بی رنگ را به یک فراورده رنگی تبدیل می کند . میزان رنگ سنجیده شده توسط اسپکتروفتومتر مقدار آنتی بادی را تعیین می کند .
مواد و وسایل مورد نیاز :