آمینوبنزوئیک اسید (p-Aminobenzoic acid)

سیگما-آلدریچ

 

تیوکتیک اسید (Thioctic acid)

سیگما-آلدریچ

 

عوامل کاهنده

 

 

 

 

سیستئین اسیدی (HCl-Cysteine)

سیگما-آلدریچ

 

سدیم سولفید (Sodium sulfide)

سیگما-آلدریچ

 

عصاره مخمر

 

مرک

 

فروکتوز

 

مرک

 

 

ترکیبات محیط کشت مایع
برای تهیه محیط کشت مایع NH₄Cl (0/1 گرم)، KCl (1/0 گرم)، MgSO₄.7H₂O (2/0 گرم)، NaCl (8/0 گرم)، KH₂PO₄ (۱/۰ گرم)، CaCl₂.2H₂O (0/20 میلی گرم)، عصاره مخمر (۰/۱گرم)، عناصر جزئی (۱۰ میلی لیتر) و محلول ویتامین ولف^[۲۳۴] (۱۰ میلی لیتر) در ۹۸۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

محلول عناصر جزئی
برای تهیه محلول عناصر جزئی مقدار ۰/۲ گرم نیتریلواستیک اسید در یک لیتر آب مقطر حل گردید و pH محلول با بهره گرفتن از محلول هیدروکسید پتاسیم روی ۰/۶ تنظیم شد. سپس MnSO₄.H₂O (0/1 گرم)، Fe(SO₄)₂(NH₄)₂.6H₂O (8/0 گرم)، CoCl₂.6H₂O (2/0 گرم)، ZnSO₄.7H₂O (2/0 گرم)،CuCl₂.2H₂O (20 میلی گرم)، NiCl₂.6H₂O (20 میلی گرم)، Na₂MoO₄.2H₂O (20 میلی گرم)، Na₂SeO₄ (۲۰ میلی گرم) و Na₂WO₄ (۲۰ میلی گرم) به محلول اضافه گردیدند.
محلول ویتامین ولف
برای تهیه محلول ویتامین، بیوتین (۰/۲ میلی گرم)، فولیک اسید (۰/۲ میلی گرم)، پیریدوکسین هیدروکلراید (۰/۱۰ میلی گرم)، تیامین (۰/۵ میلی گرم)، ریبوفلاوین (۰/۵ میلی گرم)، نیکوتینیک اسید (۰/۵ میلی گرم)، کلسیم پنتوتنات (۰/۵ میلی گرم)، ویتامین B₁₂ (۱/۰ میلی گرم)، آمینوبنزوئیک اسید (۰/۵ میلی گرم) و تیوکتیک اسید (۰/۵ میلی گرم) در یک لیتر آب مقطر حل شدند.
محلول عوامل کاهنده^[۲۳۵]
برای تهیه محلول عوامل کاهنده، هیدروکسید سدیم (۹/۰ گرم) در ۱۰۰میلی لیتر آب مقطر حل گردیده و در محیط نیتروژن جوشانده شد. سپس سیستئین (۰/۴ گرم) و بعد از آن سدیم سولفید (۰/۴ گرم) به محلول اضافه گردید. این محلول در شرایط کاملا بی هوازی در سرم باتل^[۲۳۶] Fischer Scientific)، انگلستان) ریخته شد و اتوکلاو گردید.
روش تهیه محیط کشت مایع
محیط کشت مایع بر اساس دستورالعمل شرح داده شده بدون فروکتوز و عوامل کاهنده تهیه شد. به منظور حذف اکسیژن، محلول جوشانده شد. محیط کشت جوشانده شده با وارد کردن جریانی از گاز نیتروژن به درون مایع تا دمای حدود ۴۵ درجه سانتیگراد خنک گردید. محیط کشت (۵۰ میلی لیتر) سپس در داخل چند سرم باتل (۱۶۳ میلی لیتر) توزیع گردید. مجددا گاز نیتروژن برای مدت ۲-۱ دقیقه به داخل سرم باتل فرستاده شد و در باتل ها یکی پس از دیگری بسته شدند. برای بستن سرم باتل ها، ابتدا یک درپوش لاستیکی و سپس یک روکش آلومینیومی روی باتل قرار داده شد و پس از آن توسط وسیله ای موسوم به کریمپر^[۲۳۷] (Wheaton) بسته شدند. طراحی سرم باتل ها به گونه ای است که پس از بستن در آنها، امکان ورود و خروج هوا و یا گاز دیگری وجود ندارد و این مساله برای کشت دادن ارگانیزمهای بی هوازی بسیار مهم است.
محلول فروکتوز به صورت جداگانه با غلظت ۰/۵ گرم در لیتر تهیه گردید. در تهیه این محلول نیز مراحل جوشاندن و خنک کردن با نیتروژن انجام شده و سپس سرم باتل بسته شد. محلول عوامل کاهنده نیز جداگانه به صورتی که شرح داده شد (بخش ۳-۳-۱-۳) تهیه گردید. تمامی باتل های محیط کشت، فروکتوز و عوامل کاهنده در اتوکلاو ۷۵ لیتری (Selecta، اسپانیا) در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد برای مدت زمان ۱۵ دقیقه استریل شدند.
برای آماده سازی محیط کشت، محلول فروکتوز و سپس محلول عوامل کاهنده به محیطهای کشت اصلی اضافه شدند. به منظور حصول اطمینان مجدد از ایجاد شرایط بی هوازی در داخل سرم باتل ها، گاز نیتروژن پس از عبور از فیلتر ۴۵/۰ میکرون (Sartorius) از طریق سوزن (سرسرنگ) وارد باتل گردید و از سوزن دیگری برای خروج گاز از داخل باتل استفاده گردید (تصویر ۳-۲). بدین ترتیب، گاز نیتروژن وارد باتل شده و سپس از خروجی به بیرون می رفت. پس از گذشت ۳۰ ثانیه، هر دو سوزن ورودی و خروجی برداشته شد. این مراحل در تمام آزمایشهایی که در سرم باتل انجام می گرفت، اجرا می شد.
تصویر ‏۳‑۲: نحوه وارد کردن گاز به داخل سرم باتل
روش تهیه محیط کشت جامد
برای تهیه محیط کشت جامد، ۵/۱% آگار (مرک) به محیط کشت مایع اضافه گردید. محیط کشت پس از جوشاندن در داخل لوله کشت^[۲۳۸] (Scott) ریخته شد. گاز نیتروژن به داخل لوله فرستاده شد و سپس درِ لوله های کشت بسته شد. محلول فروکتوز و عوامل کاهنده نیز به ترتیبی که توضیح داده شد تهیه گردیدند و سپس همه محلولها استریل شدند. پس از استریل شدن، تمامی محلولها به داخل محفظه بی هوازی منتقل شده و در آنجا تحت جریان گاز نیتروژن، فروکتوز و محلول عوامل کاهنده به محلول لوله کشت که هنوز داغ بود اضافه شدند. سپس در لوله ها بسته شد و در حالت شیب داری قرار داده شدند تا خنک شده و محیط کشت جامد حاصل شود. مقداری از محیط کشت نیز در پتری دیش استریل ریخته شد و در حالی که درِ آن نیمه باز بود برای مدتی در جریان گاز نیتروژن (داخل محفظه بی هوازی) قرار داده شد تا جامد شود.
نحوه تکثیر باکتری لانگالی
باکتری لانگالی از جمله باکتریهای به شدت بی هوازی است و تکثیر آن بنا به دستورالعمل ATCC باید در محیط به شدت بی هوازی صورت گیرد. بنابراین، ایجاد شرایط کاملا بی هوازی برای رشد و تکثیر از اصول اولیه کار با این باکتری بود. بدین منظور، از یک محفظه بی هوازی موسوم به گلاو باکس^[۲۳۹] استفاده گردید که نمایی از آن در تصویر ۳-۳ نشان داده شده است. قبل از استفاده از این محفظه، محلول ۲-پروپانول ۷۰% در داخل آن اسپری گردید تا آلودگیها را تا حد ممکن کاهش دهد.
تصویر ‏۳‑۳: محفظه بی هوازی همراه با کپسول نیتروژن برای ایجاد شرایط بی هوازی