۲/۰mM

۶/۰

dNTP

۵u ̷µl

۱u

۱/۰

Taq DNA Polymerase

۵pmol

۲/۰pmol

۶/۰

F^[15] – Primer

۵pmol

۲/۰pmol

۶/۰

R^[16] –Primer

۵۵/۱۰

D.D.W

۱۵

Total Volume

۳-۱۰- توالی یابی
پس از تکثیر نواحی پروموتری مورد نظر، پس از اطمینان از صحت تکثیر و کیفیت مناسب باند، در صورتی که باند مورد نظر شارپ باشد حدود ۲۲ میکرولیتر از محصول PCR در یک ویال استریل قرار داده و به همراه ۱۲۰ میکرولیتر پرایمر (پرایمر رفت برای GKN1A و پرایمر برگشت برای GKN1B) با غلظت ۱۰ پیکومول در یک ویال جداگانه که درب آن‌ها پارافیلم شده است، به خارج از کشور (کره جنوبی) جهت توالی یابی ارسال شد. توالی یابی برای هر ناحیه برای ۱۰ نمونه انجام گرفت.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۱۱- شناسایی SNP‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ پروموتر ژن GKN1
پس از توالی یابی، برای شناسایی SNP ناحیه پروموتری، ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ابتدا با نرم افزار Chromas توالی نوکلئوتیدی هر نمونه خوانده شد و سپس با نرم افزار SeqMan با یکدیگر مقایسه شدند.
۳-۱۲- تکنیک Tetra- primer ARMS- PCR
روش‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مبتنی بر آنزیم، برای تشخیص پلی مورفیسم پر هزینه و وقت گیر می باشد. تکنیکTetra- primer ARMS- PCR یک روش ساده، مقرون به صرفه و سریع برای تعیین ژنوتیپ پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ تک نوکلئوتیدی (SNP) با بهره گرفتن از ۴ پرایمر در یک واکنش PCR به صورت همزمان می باشد. در این روش از یک جفت پرایمر خارجی و یک جفت پرایمر داخلی استفاده می شود که پرایمرهای داخلی به صورتی طراحی می‌‌‌‌‌‌‌‌شوند که انتهای ˊ۳ آن‌ها اختصاصی SNP می‌‌‌‌‌‌‌‌باشد )شکل ۳-۱).
در این روش عوامل زیادی می‌‌‌‌‌‌‌‌توانند به عنوان مداخله گر عمل کنند بنابراین کیفیت استخراج DNA، غلظت مواد از جمله غلظت Mgcl₂ و غلظت پرایمرها بسیار مهم است. متعادل کردن پرایمر‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ داخلی یک مرحله کلیدی محسوب می‌‌‌‌‌‌‌‌شود و می‌‌‌‌‌‌‌‌توان با افزایش غلظت پرایمر‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ داخلی این تعادل را ایجاد کرد (۵۱، ۵۲ و ۵۳).
شکل ۳-۱: نمایی از تکنیک Tetra Primer ARMS- PCR
۳-۱۳- تعیین ژنوتیپ SNP با شناسه‌های rs4575760 و rs4072127 با روش Tetra- primer ARMS- PCR
پس از مشخص شدن SNP‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ناحیه پروموتری ژن GKN1 با توالی یابی، در بقیه افراد برای تعیین ژنوتیپ rs4575760 و rs4072127 از روش Tetra- primer ARMS PCR استفاده شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده و شرایط Tetra- primer ARMS PCR در جدول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌۳-۵، ۳-۶، ۳-۷، ۳-۸، ۳-۹ و ۳-۱۰ آمده است.
جدول ۳-۵: توالی پرایمرهای مورد استفاده در Tetra- primer ARMS PCR برای تعیین ژنوتیپ rs4575760