برای اندازه گیری خاکستر، کروزهها را به وزن ثابت رسانده شد. به این منظور کروزهها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۶۰۰ درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس یک تا ۲ گرم از نمونه های مورد بررسی، درون کروزه وزن شدند و تا پایان متصاعد شدن دود روی اجاق الکتریکی قرار داده شد. سپس کروزه‌ها در دمای ۵۵۰ تا ۶۰۰ درجه به مدت ۵ ساعت قرار داده شدند. در انتهای این زمان نباید دیگر ذرات سیاه رنگ در کروزه مشاهده شود. سپس کروزهها را در دسیکاتور قرار داده شدند و نمونه ها وزن شدند. درصد خاکستر از فرمول زیر محاسبه شد (سوزان- نیلسون، ۲۰۱۰):

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

= درصد خاکستر
۳-۳-۲- اندازه گیری رطوبت و ماده خشک
ابتدا ظروف آلومینیومی به همراه درب آنها در آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه قرار گذاشته شد. سپس آنها را به دسیکاتور انتقال داده تا سرد شده و به دمای ثابت برسند. ۱ تا ۲ گرم نمونه در ظروف توزین شد و تا زمان رسیدن به وزن ثابت در آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. بعد از خارجکردن از آون و سرد کردن ظروف حاوی نمونه مجددا آنها را توزین کرده و درصد رطوبت یا ماده خشک با بهره گرفتن از فرمولهای زیر محاسبه شدند (واسیلجویک، ۲۰۰۷).
درصد رطوبت-۱۰۰= درصد ماده خشک
۳-۳-۳- اندازه گیری چربی
۳-۳-۳-۱- روش سوکسله
اندازه گیری چربی، برای صمغ فارسی و شیر خشک با روش سوکسله انجام شد و درصد چربی با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد:
= درصد چربی
۳-۳-۳-۲- روش ژربر
اندازه گیری چربی برای نمونه های ماست به روش ژربر انجام شد.
۳-۳-۴- اندازه گیری پروتئین و ازت کل
اندازه گیری پروتئین و ازت کل در سه مرحله هضم، تقطیر و تیتراسیون انجام شد.
الف- هضم
در این مرحله ۵/۱ گرم نمونه استفاده شد، ولی برای نمونههایی که مقدار پروتئین بالا دارند ۵/۰ گرم از نمونه کافی میباشد. ۵/۰ گرم از نمونه شیر خشک و ۵/۱ گرم نمونه های ماست و صمغ فارسی را در فلاسک هضم مخصوص کلدال ریخته و ۱/۱۱ گرم کاتالیزور(مخلوط سولفات پتاسیم، سولفات مس و سلنیم به ترتیب با نسبت ۱:۱۰:۱۰۰) همراه با ۲۵ میلیلیتر اسیدسولفوریک غلیظ به آن اضافه شد. ابتدا به فلاسکهای روی دستگاه هضم مخصوص، حرارت ملایم داده شد تا کف کردن محلولها متوقف شود. سپس حرارت را بالا برده تا محلولها بجوشند. این عمل تا زمان روشن شدن رنگ محلولها ادامه یافت. لازم به ذکر است نمونه های ماست بعد از اینکه در فلاسک هضم ریخته شدند، به مدت ۱ساعت درون آون و در دمای ملایم خشک شدند.
ب- تقطیر
بعد از مرحلهی هضم و تشکیل محلول زلال، نمونه ها را در دستگاه تقطیر قرار داده و ۴۰ میلیلیتر آب مقطر و ۱۲۰ میلیلیتر سود ۵۰ درصد به آنها اضافه شد و با برقراری جریان در داخل دستگاه، آمونیاک آزاد شد و در ارلن مایر حاوی ۵۰ میلیلیتر اسید بوریک ۲ درصد و چند قطره معرف فنول رد حل و جمعآوری شد. حل شدن تدریجی آمونیاک باعث تغییر رنگ نمونه های درون ارلن مایر به زرد شد. مرحلهی تقطیر تا زمان رسیدن محلولها به حجم ۲۰۰ میلی لیتر ادامه یافت.
ج- تیتراسیون
بعد از خارج کردن نمونه ها از زیر دستگاه تقطیر، آمونیاک موجود در آنها با اسید کلریدریک ۱/۰ نرمال تیتر شد و درصد پروتئین با فرمول زیر محاسبه شد (سوزان - نیلسون، ۲۰۱۰).

۳۸/۶× درصد ازت = درصد پروتئین
۳-۳-۵- اندازه گیری اسیدیته بر حسب اسید لاکتیک
۱ تا ۲ گرم نمونه را در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر با دمای ۸۰ درجه سانتیگراد حل کرده سپس در برابر معرف فنلفتالئین ۲ درصد، تا ایجاد رنگ صورتی پایدار با سود ۱/۰نرمال استاندارد شده، تیترشد. مطابق رابطه زیر اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک تعیین گردید (سوزان- نیلسون، ۲۰۱۰):
لاکتیک
۳-۵- رسم منحنی رشد
برای رسم منحنی رشد ۱ درصد از کشت فعال به ۵۰ میلیلیتر MRS مایع اضافه شد و در انکوباتور CO_2- دار در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد نگهداری شد. ابتدا به مدت ۲ ساعت، هر نیم ساعت یکبار و بعد از این مدت هر دو ساعت یکبار نمونه برداری انجام شد و هر نمونه تا رقت ۱۰^۷ رقیق شد و از رقتهای ۱۰^۴ تا ۱۰^۷ به روش مایلز- میزرا بر روی محیط MRS جامد کشت داده شد. در این روش هر پتری به ۴ قسمت مساوی تقسیم شده و در هر قسمت ۴۰ میکرولیتر از رقت مورد نظر کشت داده میشود. پس از خشک شدن، پلیت ها به انکوباتور بیهوازی با دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد منتقل شده و بعد از ۴۸ ساعت شمارش انجام می شود. جمعیت باکتریها از حاصلضرب این عدد در عکس ضریب رقت و در ۲۵ به دست میآید (نوربخش، س. ح، ۱۳۹۱).
۳-۶- تهیه سوسپانسیون فعال سلولی جهت ریزپوشانی
برای آمادهسازی سوسپانسیون فعال سلولی ده درصد از ساب کالچر نهایی به دو ارلن مایر یک لیتری محتوی ۵۰۰ سی‌سیMRS مایع استریل انتقال داده شد و به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد تحت شرایط بیهوازی (۵ درصد CO₂) انکوبهگذاری شد. بعد از ۱۸ ساعت که همزمان با شروع فاز سکون در باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم است، تودهی سلولی توسط سانتریفیوژ (۵ دقیقه با دمای ۴ درجه سانتی گراد و شتاب g´ ۴۵۰۰) جمعآوری شد. سپس محیط کشت را جدا کرده و تودهی سلولی دو مرتبه به وسیله پپتون واتر ۱/۰ درصداستریل تحت شرایط قبلی شسته شد. در نهایت تودهی سلولی در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد. شمارش سلولی سوسپانسیون ۴۸ ساعت بعد از کشت سطحی بر روی MRS جامد و در شرایط بیهوازی و دمای ۳۷ درجه انجام شد (چاواری و همکاران، ۲۰۱۰).
۳-۷- فرایندهای ریزپوشانی
آمادهسازی امولسیون دوگانه
امولسیون در دمای اتاق، با بهره گرفتن از روش امولسیون دو مرحلهای تهیه شد. در مرحله اول امولسیون اولیه آب در روغن به وسیلهی توده سلولی حاویcfu/ml 10⁸ باکتری است، به امولسیون تبدیل میشود. برای فاز روغن در این مرحله از روغن کانولا استفاده شد. غلظت کلی امولسیفایرها در این مرحله ۸ درصد وزنی- وزنی بود (۱ قسمت امولسیفایر هیدروفیل و ۴ قسمت امولسیفایر لیپوفیل). امولسیفایر هیدروفیل DATEM و امولسیفایر لیپوفیل PGPR بود. امولسیون اولیه دارای نسبت حجمی فاز پراکنده ۵/۰ بود.
تهیه امولسیون به وسیله هموژنایزر انجام شد و در مرحله اول برای تشکیل امولسیون آب در روغن، با دور rpm9000 به مدت ۵ دقیقه انجام شد. سوسپانسیون سلولی توسط سرنگ استریل به صورت قطره قطره دا خل روغن ریخته شد.
در مرحله دوم ml40 از امولسیون آب در روغن اولیه به صورتی که در مرحله اول اضافه شد، به ml60 صمغ فارسی ۵ درصد اضافه شد. دور و زمان هموژنایزر در این مرحله به ترتیب rpm4500 و ۵ دقیقه بود (گنزالس و همکاران، ۲۰۰۹).
۳-۸- آنالیز رهایش سلولها از ریزپوشینهها
امولسیون دوگانه که حاوی سلولهای به دام افتاده بود در سرعت g15800 و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شدند. تحت این شرایط امولسیون دوگانه شکسته شده و سلولهای به دام افتاده آزاد شدند. سپس نمونه های ml1 از امولسیون شکسته در ml9 از بافر فسفات ۲/۰ مولار حل شد. پس از آن مجددا یک دقیقه با ورتکس هم زده شد تا اطمینان حاصل شود که رهایش سلولها از کپسول به صورت کامل صورت گرفته است. ۱۰۰ میکرولیتراز محلول فوق به یک میکروتیوب حاوی ۹۰۰ میکرولیتر بافر فسفات استریل اضافه شد و تا رقت ^۸-۱۰ رقیق سازی انجام شد. به منظور ارزیابی جمعیت باکتری زنده مانده و رها شده از داخل ریزپوشینه ها از ۴ رقت آخر به روش مایلز- میزرا بر روی محیط کشت MRS جامد کشت داده شد و بعد از گرمخانهگذاری با دمای ۳۷ درجه سانتی گراد برای ۴۸ ساعت در انکوباتور بیهوازی، شمارش صورت گرفت. شمارش در سه تکرار و هر تکرار در سه مشاهده انجام شد(گنزالس و همکاران، ۲۰۰۹).
۳-۹- محاسبهی بازده فرایند ریزپوشانی
به منظورارزیابی بازده فرایند ریزپوشانی ابتدا شمارش سلولهای لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در سوسپانسیون اولیهای که به امولسیون دوگانه وارد شده حساب شد و سپس در مورد باکتریهای ریزپوشانیشده رهایش سلولها صورت گرفت و شمارش به روش بند ۳-۷ انجام شد. بازده ریزپوشانی^[۶۴] با فرمول زیر محاسبه شد: (EY = بازده فرایند ریزپوشانی)
(۳-۹)
N جمعیت باکتریهای زنده در هر گرم از ریزپوشینه و N₀ جمعیت سلولی اولیه میباشد.
۳-۱۰- بررسی مورفولوژی ریزپوشینهها توسط میکروسکوپ نوری
از چندین نمونه ریزپوشینه تصویر تهیه شد و مورفولوژی ریزپوشینهها بررسی گردید. برای تهیهی تصویر نمونه ها ابتدا از کپسولهای تهیه شده گستره تهیه شد.
۳-۱۱- تهیهی ماست پروبیوتیک و ارزیابی خصوصیات میکروبیولوژیکی، فیزیکی و حسی نمونه های ماست
۳-۱۱-۱- تهیه ماست پروبیوتیک
در شکل ۳-۱ فرایند تولید نمونه های ماست ارائه شده است. دو نمونه ماست، به منظور ارزیابی میزان بقاء سلولهای آزاد و ریزپوشانیشده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 تهیه شد. یک نمونه ماست به عنوان نموته کنترل تهیه شد که به آن هیچ کدام از سلولهای آزاد یا ریزپوشانی شده اضافه نشدند. جهت تولید ماست پروبیوتیک،۲۰۰ سیسی از امولسیون تشکیل شده از سلولهای ریزپوشانیشده به ۲۰۰۰ سیسی شیر بدون چربی اضافه شد. همچنین ۲۰ سیسی از سوسپانسیون سلولی آزاد به همین مقدار شیر بدون چربی به منظور تولید ماست پروبیوتیک از سلولهای بدون ریزپوشینه اضافه شد. در نهایت نمونه های ماست در شرایط یخچال، در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند و آنالیز میکروبیولوژی و حسی آنها طی ۲۱ روز نگهداری بررسی شد. آنالیز روز صفر(بعد از سرد شدن نمونه ها) و بقیه آنالیزها در روزهای ۳، ۶، ۹، ۱۲، ۱۵، ۱۸ و ۲۱ انجام شد. تمامی آزمایشات و شمارش سلولی تیمارها در سه تکرار و سه مشاهده انجام و نتایج به صورت میانگین داده ها گزارش شد)پیکوت و همکاران، ۲۰۰۴).
لازم به ذکر است نمونه های ریزپوشانیشده بدون اضافه شدن به ماست در یخچال به مدت ۲۱ روز نگهداری شد و زندهمانی باکتری در طی این دوره، مطابق با بند ۳-۸ بررسی شد.